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納米抗體作為一種用途廣泛的小分子抗體，因其體積小、親水性強、穩(wěn)定性好、易于生產(chǎn)等優(yōu)勢越來越受歡迎，尤其在疾病診斷與治療、病原檢測、藥物殘留分析、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域都展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。
納米抗體(Nanobody，Nb)指重鏈單域抗體VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody) ，該類抗體只包含一個重鏈可變區(qū)（VHH）和CH2，CH3區(qū)，相比于其他抗體，輕鏈天然缺失。納米抗體晶體直徑2.5nm，長4nm，分子量一般在12-15KD，是自然存在的可以和抗原結(jié)合的最小片段。
納米抗體VHH的表面大概只有10個氨基酸與人VH的不同，在FR2中存在有四個特異的氨基酸：普通抗體FR2中V37、G44、L45和W47這4個氨基酸殘基是在進(jìn)化中相當(dāng)保守的疏水性殘基，而VHH中，這四個突變?yōu)橛H水性的氨基酸殘基F37、E44、 R45、G47，增加了VHH的水溶性。利用這一特性，可將人源抗體VH的序列進(jìn)行優(yōu)化，對FR2中的一些氨基酸進(jìn)行VHH特征性改造，從而使VH抗體的穩(wěn)定性和溶解性更好，并且保持原有的特異性和親和力。
納米抗體和傳統(tǒng)抗體的優(yōu)劣對比
| 性能 | 傳統(tǒng)抗體 | 納米抗體 |
| 抗體表達(dá) | 在哺乳表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，周期長、成本高 | 既可在哺乳系統(tǒng)中表達(dá)，又可在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，表達(dá)的抗體具有高水溶性、易復(fù)性 |
| 抗體穩(wěn)定性 | 易失活，高溫或極度PH下失效或分解 | 高穩(wěn)定性，高耐性，90℃處理后依然保持較高的活性 |
| 免疫原性 | 較高 | 較低 |
| 組織穿透力 | 較低 | 較高，可穿透血腦屏障 |
| 半衰期 | 較長 | 較短，血清清除速度快 |
納米抗體的制備
目前，制備納米抗體主要途徑使用免疫庫和天然庫進(jìn)行制備。普健生物通過十余年的抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)的積累和迭代，具備完善的納米抗體天然庫和免疫庫制備平臺，提供羊駝免疫，納米抗體VHH噬菌體建庫及淘選技術(shù)服務(wù)，更有千億級VHH納米抗體天然噬菌體文庫可淘選各類靶點抗原，大大縮短藥物開發(fā)周期。
| 服務(wù)項目 | 服務(wù)內(nèi)容 | 服務(wù)周期 | 交付內(nèi)容 |
| 天然庫淘選 | 3-4輪淘選 多克隆ELISA驗證 單克隆ELISA驗證 陽性克隆ELISA驗證 測序 實驗報告 |
4周 | 陽性菌株1-3株 VHH序列1-3條 技術(shù)服務(wù)報告 |
| 免疫庫建庫及淘選 | 抗原質(zhì)檢 羊駝免疫 噬菌體文庫構(gòu)建 噬菌體文庫淘選 |
10周 | 噬菌體免疫文庫(大于5*108 pfu的phage) 陽性菌株5-10株 VHH序列5-10條 技術(shù)服務(wù)報告 |
針對靶點B的特異性納米抗體制備過程
普健生物可以提供針對特定靶點的特異性納米抗體定制服務(wù)，包括抗原檢測，羊駝免疫，采血，效價檢測，納米抗體噬菌體庫構(gòu)建及淘選，特異性高親和力納米抗體篩選，表達(dá)，檢測一條龍服務(wù)。親和力可以達(dá)到108~1010M級別。
1. 靶點B免疫羊駝，進(jìn)行四輪免疫后采血提取PBMC，經(jīng)RNA提取，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后擴(kuò)增獲取VHH可變區(qū)片段；
2. 免疫羊駝納米抗體庫的構(gòu)建：
將獲得的VHH可變區(qū)片段連入噬菌體展示載體，電轉(zhuǎn)宿主菌，最終獲得庫容為8.76x10^9納米抗體庫，插入正確率為100%
3. 免疫羊駝納米抗體庫的淘選及篩選：
利用構(gòu)建的免疫羊駝納米抗體庫，針對靶點B蛋白，完成三輪淘選，其淘選富集度如下：
篩選96個克隆，其中陽性克隆共94個，陽性率為97.9%。
排除重復(fù)序列，最終獲得了7條不同的抗體序列。將這些抗體序列表達(dá)成可溶性的VHH抗體蛋白，進(jìn)行再次驗證，結(jié)果如下：
隨機(jī)挑選兩條抗體蛋白進(jìn)行親和力測定，結(jié)果如下：
R1P1-A10：KD：6.49E-09M
R1P1-H12：KD：1.52E-07M
