大腸桿菌原核蛋白表達的操作步驟和相關(guān)注意事項

　　采用大腸桿菌表達蛋白是現(xiàn)階段使用非常廣泛的一項技術(shù)，我們一般將這種方法稱為原核表達。這個方法的使用范圍非常的廣泛，比如在蛋白純化、定位以及相關(guān)蛋白功能分析等。因為大腸桿菌易于控制和生長，而且價格相對便宜，使得其使用極為廣泛。

　　大腸桿菌蛋白表達時，常常會使用載體(通常為質(zhì)粒)來表達目的蛋白。原核表達通常按照：獲得目的蛋白、構(gòu)建表達載體、插入目的基因、培養(yǎng)宿主菌、誘導(dǎo)蛋白表達、蛋白分析，最后通過擴增、純化等操作后，進行進一步檢測;

　　其具體操作步驟如下：

　　1、獲得目的基因

　　獲得目的基因的方法主要有兩種，一種是PCR方法，一種是RT-PCR方法，另外一種是人工合成法。

　　PCR法：以含有目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，通過基因序列設(shè)計一對引物，從而獲得基因片段;

　　RT-PCR法：從細胞或組織中提取RNA，而后以RNA逆轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈，而后以逆轉(zhuǎn)錄為模板獲得目的基因;

　　人工合成法：通過檢測到的目的基因序列，合成重疊的單鏈寡合苷酸，而后通過重疊延伸PCR法拼接出全長;

　　2、構(gòu)建表達載體

　　使用限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒進行雙酶切，而后對酶切的產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，從而獲得載體大片段，而后通過相關(guān)技術(shù)手段將目的基因連入載體;

　　3、質(zhì)粒構(gòu)建

　　將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌，而后對相關(guān)細菌進行挑選，再然后通過裂解法提取質(zhì)粒，最后檢測目的基因的插入方向并論證其正確性;

　　4、誘導(dǎo)表達

　　對含有目的基因的菌體進行培養(yǎng)，而后取部分液體與未誘導(dǎo)組進行對照，培養(yǎng)完成后，離心后取上清液作為樣品;

　　大腸桿菌蛋白表達的注意事項有哪些?

　　1、在我們選擇表達載體時，一定要根據(jù)蛋白的最終應(yīng)用來進行選擇;

　　2、在進行外源DNA連接時，需要確保其轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)移過程中不會出現(xiàn)相互干擾的情況;

　　大腸桿菌蛋白表達作為現(xiàn)階段使用最為廣泛的原核蛋白表達系統(tǒng)，因為其遺傳背景清晰的優(yōu)勢，在蛋白表達上有著極大的優(yōu)勢。在進行相關(guān)蛋白表達時，需要嚴格按照實驗標準來操作，這樣才能在更大程度上保證蛋白的表達。武漢普健生物專業(yè)為廣大用戶提供原核蛋白表達服務(wù)，如果您有相關(guān)需求，歡迎來電咨詢。