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一、需求分析
客戶需求：可提供蛋白序列，希望得到純度85%左右的500μg蛋白，蛋白后續(xù)用于酶活實(shí)驗(yàn)，項(xiàng)目預(yù)算有限，后期可能需要大量蛋白。
需求分析
如項(xiàng)目預(yù)算有限，建議優(yōu)先選擇原核表達(dá)系統(tǒng)，成本較為低廉，如后續(xù)需要進(jìn)行大體積放大，可直接進(jìn)行發(fā)酵，工藝成本更低;對于酶的表達(dá)，普健的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在已往項(xiàng)目中有較為積極的客戶反饋; 基于以上分析，普健建議該項(xiàng)目選用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。
二、蛋白性質(zhì)分析
將蛋白序列在蛋白數(shù)據(jù)庫Uniport中比對，一致性較高為80.9%，用生物信息學(xué)工具進(jìn)行蛋白性質(zhì)分析。
跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測：
信號肽預(yù)測：
疏水性預(yù)測：
蛋白性質(zhì)總結(jié)：客戶提供蛋白序列一共234 AAs，蛋白大小為25.39 KDa，pI為8.80，疏水性一般，無跨膜結(jié) 構(gòu)域，無信號肽，無糖基化及二硫鍵修飾。
三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
綜合蛋白性質(zhì)及客戶需求分析，設(shè)計(jì)蛋白表達(dá)方案如下：選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)目的蛋白全長，N端融合6*His標(biāo)簽，表達(dá)載體為pET28b，選用BL21(DE3)、T7E為表達(dá)菌株，設(shè)置多個(gè)誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間，根據(jù)表達(dá)測試結(jié)果，選擇最優(yōu)條件進(jìn)行200mL放大，收集樣品采用Ni柱純化，交付蛋白樣品。
四、實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、表達(dá)載體構(gòu)建
利用生物信息學(xué)工具對目的蛋白全長片段進(jìn)行密碼子優(yōu)化，降低稀有密碼子水平，用化學(xué)合成方法獲得目的蛋白基因序列片段，將片段亞克隆到pET28b表達(dá)載體，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證及測序確認(rèn)。進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證及測序確認(rèn)。
測序結(jié)果：
雙酶切驗(yàn)證結(jié)果：
結(jié)果分析：NdeI/XhoI雙酶切測試結(jié)果顯示片段大小正確，測序結(jié)果顯示序列一致，確認(rèn)蛋白表達(dá)載體構(gòu)建成功。
2、表達(dá)測試
將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)菌株、T7E菌株，挑取陽性克隆轉(zhuǎn)移到含Kana抗性的LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)3-4h，加入1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，一組37℃培養(yǎng)4h，另一組16℃培養(yǎng)16h過夜，收集蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測。
SDS-PAGE結(jié)果：
結(jié)果分析：根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果，蛋白大小在25KD左右，與預(yù)測蛋白大小相符，比較各條件下蛋白表達(dá)情況，確認(rèn)該蛋白最優(yōu)的表達(dá)條件如下：
| 菌株 | 溫度 | 誘導(dǎo)時(shí)間 |
| T7E 菌株 | 37℃ | 4h |
3、放大純化
按照得到的最優(yōu)表達(dá)條件，轉(zhuǎn)化200mL大腸桿菌，37℃培養(yǎng)3-4h，1mM IPTG誘導(dǎo)后，37℃培養(yǎng)4h，收集蛋白樣品，用Ni柱進(jìn)行蛋白純化，得到最終蛋白樣品。
4、QC檢測
將最終得到的蛋白樣品進(jìn)行濃度測定、SDS-PAGE檢測及His標(biāo)簽抗體的WB檢測。
SDS-PAGE檢測及WB檢測結(jié)果：
結(jié)果分析：SDS-PAGE結(jié)果顯示蛋白大小在25KD左右，且蛋白純度較好，約為95%; His標(biāo)簽抗體的WB檢測結(jié)果顯示25KD左右曝出條帶，與目的蛋白預(yù)測大小相符。
五、交付材料
| 序號 | 樣品 | 濃度 | 分裝 | 緩沖液 | 管數(shù) |
| 1 | 蛋白 | 1.00mg/ml | 1.50ml/管 | PBS pH7.5 | 2管 |
| 2 | 表達(dá)載體 | 100ng/ul | 15ul/管 | TE | 1管 |
| 3 | 表達(dá)菌株 | / | 1.00ml/管 | / | 1管 |
| 合計(jì)管數(shù): | 4管 | ||||
六、項(xiàng)目結(jié)題
從基因合成到交付蛋白樣品，項(xiàng)目為期5周，得到3.00mg目的蛋白樣品，由于酶活測試的多樣性與特殊性，交付給客戶進(jìn)行驗(yàn)收及酶活測試，客戶驗(yàn)證蛋白大小純度均與QC結(jié)果一致，酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蛋白有生物活性，綜上，項(xiàng)目順利結(jié)題。
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